周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (15): 2383-2389.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.015

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周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导

王爽玉¹，王洪玲²，夏晨蕾¹，丁弦¹，孙仙蕊³，张强¹，李建平¹，阎潇¹，刘文¹，张月¹，姚如永⁴，袁晓¹

¹青岛大学医学院附属青岛市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266071；²泰安市口腔医院，山东省泰安市 271000；3威海市口腔医院，山东省威海市 264200；⁴青岛大学医学院附属医院中心实验室，山东省青岛市 266003

出版日期:2014-04-09 发布日期:2014-04-09
通讯作者: 袁晓，教授，硕士生导师，青岛大学医学院附属青岛市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266071
作者简介:王爽玉，女，1988年生，山东省荣成市人，汉族，2014年青岛大学医学院毕业，硕士，主要从事牙颌畸形矫治机理研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31170891)

Caspase-9 in myoblasts is involved in mechanical signal transdunction under cyclic stretch

Wang Shuang-yu¹, Wang Hong-ling², Xia Chen-lei¹, Ding Xian¹, Sun Xian-rui³, Zhang Qiang¹, Li Jian-ping¹, Yan Xiao¹, Liu Wen¹, Zhang Yue¹, Yao Ru-yong⁴, Yuan Xiao¹

¹ Department of Stomatology, Affiliated Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China;² Taian Stomatology Hospital, Taian 271000, Shandong Provine, China; ³Weihai Stomatology Hospital, Weihai 264200, Shandong Province, China; ⁴Central Laboratory, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Online:2014-04-09 Published:2014-04-09
Contact: Yuan Xiao, Professor, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Affiliated Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Wang Shuang-yu, Master, Department of Stomatology, Affiliated Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31170891

摘要/Abstract

摘要：

背景：功能矫形使面颌部肌肉发生适应性改建，以纠正错颌畸形。成肌细胞是适应性改建的主要体现者，周期性牵张应力导致成肌细胞凋亡，而半胱天冬氨酸蛋白酶9是线粒体凋亡通路中的重要因子。
目的：明确半胱天冬氨酸蛋白酶9在不同时间周期性张应力作用下的表达变化。
方法：以大鼠L6成肌细胞为实验对象，在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上，通过多通道细胞牵张应力加载系统，分别对待测细胞持续施加1，6，12，24 h的周期性张应力，不加力组为对照组。倒置相差显微镜下观察成肌细胞的形态学改变和生长状况；运用RT-PCR和Western Blot技术检测周期性张应力作用下半胱天冬氨酸蛋白酶9的mRNA和蛋白含量变化。
结果与结论：倒置相差显微镜观察结果显示成肌细胞施加周期性张应力后贴壁生长情况良好，细胞无变性并且脱落率极低，说明成功构建了成肌细胞体外培养-力学刺激模型。RT-PCR和Western Blot检测结果显示，随着加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA含量和活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9的蛋白含量均显著增加，而半胱天冬氨酸蛋白酶9前体蛋白含量随着加力时间的延长均显著降低。可见半胱天冬氨酸蛋白酶9参与了周期性张应力作用下的力学信号传导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 半胱天冬氨酸蛋白酶9, 周期性张应力, 成肌细胞, 凋亡, 线粒体通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The adaptive reconstruction of maxillofacial muscles would happen when functional orthopedic treatment is done to cure micromaxillary deformity. The myoblast is the main responder in the process of adaptive reconstruction, and cyclic stretch can induce apoptosis of myoblasts. Caspase-9 is an important factor in the mitochondrial apoptosis pathway.
OBJECTIVE: To investigate the expression of Caspase-9 in different cyclic stretch.
METHODS: Based on myoblasts cultured in vitro-mechanical stimulation model, the rat L6 myoblasts were loaded stretch for 1, 6, 12 and 24 hours through multi-channel cell stress loading system, while the control group received no stretch. The morphological change and growth of myoblasts were observed under inverted phase contrast microscope; the expression of the mRNA and protein of Caspase-9 were detected by RT-PCR and western blot analysis, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Under inverted phase contrast microscope, the rat L6 myoblasts at cyclic stretch maintained a good growth state and biological characteristics; there was no cell degeneration; and the loss rate was extremely low, which could demonstrate that myoblast in vitro-mechanical stimulation model was established successfully. The results of RT-PCR and western blot analysis showed that, the expression of Caspase-9 mRNA and Cleaved Caspase-9 protein was significantly increased as the loading time prolonged, and the expression of Procaspase-9 protein was significantly decreased as the time. We can conclude that Caspase-9 is involved in the mechanical signal transduction of cyclic stretch.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Caspase-9, myoblasts, apoptosis, mitochondria, reverse transcription polymerase chain reaction

中图分类号:

R318

王爽玉，王洪玲，夏晨蕾，丁弦，孙仙蕊，张强，李建平，阎潇，刘文，张月，姚如永，袁晓. 周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2383-2389.

Wang Shuang-yu, Wang Hong-ling, Xia Chen-lei, Ding Xian, Sun Xian-rui, Zhang Qiang, Li Jian-ping, Yan Xiao, Liu Wen, Zhang Yue, Yao Ru-yong, Yuan Xiao. Caspase-9 in myoblasts is involved in mechanical signal transdunction under cyclic stretch[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2383-2389.

图/表（结果） 7

2.1 成肌细胞体外培养的镜下观察结果 传代培养后的细胞，在新培养液中先表现为悬浮状态，也就是细胞的悬浮期，镜下可见细胞胞质回缩，胞体呈圆球状；在10 min-4 h内，部分细胞开始贴壁，悬浮期结束，到达细胞贴壁期；继续培养12 h后，大部分成肌细胞己经贴壁，镜下观察可见，细胞形态不再是圆形，而是呈梭形或不规则的三角形。胞核在中央，呈卵圆形，胞质向外伸出长短不同的突起；24 h后，细胞完全贴壁，细胞开始进行分裂增殖，细胞数量逐渐增加；48 h后，细胞的分裂增殖更加活跃，细胞数量成倍增加，细胞形态变为扁梭形，进入对数生长期(又称指数生长期)，此期细胞活力最佳，是进行实验研究的最佳选择；继续培养4 d左右后，细胞数量越来越多，细胞的生长空间越来越少，细胞相互接触汇合成片，出现接触抑制。对成肌细胞施加周期性应力后，成肌细胞由原先的杂乱无章转为顺应力场方向排列，持续加力后这种作用趋势变得更加明显。倒置相差显微镜下观察成肌细胞在施加周期性张应力后贴壁生长情况良好，细胞无变性并且脱落率极低，说明成功构建了成肌细胞体外培养-力学刺激模型(图1)。

2.2 成肌细胞体外培养的生长曲线 根据对成肌细胞传代后的观察以及细胞计数，绘制生长曲线(图2)。

经传代培养后，细胞数量渐渐增多，大约在第2天进入细胞的对数生长期；第4天左右增殖达高峰，第5天后由于接触抑制，细胞增殖减慢。由于对数生长期的细胞处于增殖旺盛阶段，此期细胞活力最佳，常被选作实验的研究对象。

2.3 RT-PCR检测周期性张应力下半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA含量的表达变化 RT-PCR检测结果显示，随着加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA的含量逐渐增高，24 h达到最高，差异有非常显著性意义(P < 0.01，表1及图3)。

2.4 Western Blot检测周期性张应力下半胱天冬氨酸蛋白酶9蛋白含量的表达变化 随着加力时间的延长，加力6，12，24 h组半胱天冬氨酸蛋白酶9前体的蛋白含量与对照组比较均明显降低，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；加力6，12，24 h组活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9的蛋白含量与对照组比较明显增加，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2，3及图4。

参考文献

[1]Matsunaga K, Usui A, Yamaguchi K, et al. An anatomical study of the muscles that attach to the articular disc of the temporomandibular joint. Clin Anat. 2009;22(8):932-940.
[2]Tanaka E, Hirose M, Inubushi T, et al. Effect of hyperactivity of the lateral pterygoid muscle on the temporomandibular joint disk. J Biomech Eng. 2007;129(6):890-897.
[3]Wang L, Pan J, Wang T, et al. Pathological cyclic strain-induced apoptosis in human periodontal ligament cells through the RhoGDIalpha/caspase-3/PARP pathway. PLoS One. 2013;8(10):e75973.
[4]Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver disease. Am J Med. 2000;108(7):567-574.
[5]Liu J, Wang Y, Yuan X, et al. Cyclic-stretch induces the apoptosis of myoblast by activation of Caspase-3 protease in a magnitude-dependent manner. Int J Biochem Cell Biol. 2010;42(12):2004-2011.
[6]唐惠玲.线粒体介导的细胞凋亡的研究进展[J].安徽医药,2012, 16(11):1696-1699.
[7]Jiang X, Wang X. Cytochrome C-mediated apoptosis. Annu Rev Biochem. 2004;73:87-106.
[8]Huttemann M, Helling S, Sanderson TH, et al. Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling: cytochrome c oxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation. Biochim Biophys Acta. 2012;1817(4):598-609.
[9]Gu S, Zhao Y, Guo J, et al. High expression of APAF-1 elevates erythroid apoptosis in iron overload myelodysplastic syndrome. Tumour Biol. 2014;35(3): 2211-2218.
[10]Sun KW, Ma YY, Guan TP, et al. Oridonin induces apoptosis in gastric cancer through Apaf-1, cytochrome c and caspase-3 signaling pathway. World J Gastroenterol. 2012;18(48):7166-7174.
[11]Shoshan-Barmatz V, Keinan N, Abu-Hamad S, et al. Apoptosis is regulated by the VDAC1 N-terminal region and by VDAC oligomerization: release of cytochrome c, AIF and Smac/Diablo. Biochim Biophys Acta. 2010;1797(6-7): 1281-1291.
[12]王辉,张琳,沈树娜. Caspases家族在妇科疾病中的研究进展[J]. 医学综述,2012,18(9):1314-1316.
[13]Porter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 1999;6(2):99-104.
[14]Salakou S, Kardamakis D, Tsamandas AC, et al. Increased Bax/Bcl-2 ratio up-regulates caspase-3 and increases apoptosis in the thymus of patients with myasthenia gravis. In Vivo. 2007;21(1):123-132.
[15]Renatus M, Stennicke HR, Scott FL, et al. Dimer formation drives the activation of the cell death protease caspase 9. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(25):14250-14255.
[16]Acehan D, Jiang X, Morgan DG, et al. Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell. 2002; 9(2): 423-432.
[17]田臻,杨竹丽,贾文敏,等. p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡(英文)[J].中国组织工程研究与临床康复,2011, 15(15):2751-2754.
[18]阎潇. Caspase-3在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其机制[D].青岛:青岛大学,2012.
[19]Khan A, Farah CS, Savage NW, et al. Th1 cytokines in oral lichen planus. J Oral Pathol Med. 2003;32(2):77-83.
[20]胡锴,刘好朋,万婷,等. 线粒体与细胞凋亡的关系[J].中国畜牧兽医,2010,37(12):86-88.
[21]Czerniczyniec A, Bustamante J, Lores-Arnaiz S. Improvement of mouse brain mitochondrial function after deprenyl treatment. Neuroscience. 2007;144(2):685-693.
[22]Bellido T, Huening M, Raval-Pandya M, et al. Calbindin-D28k is expressed in osteoblastic cells and suppresses their apoptosis by inhibiting caspase-3 activity. J Biol Chem. 2000;275(34):26328-26332.
[23]朱炎杰,高维娟. Cyt-C与caspase在细胞凋亡中的作用及相互关系[J]. 中国老年学杂志,2011,31(15):2990-2992.
[24]刘晓婷,王延让,张明. 线粒体介导细胞凋亡的研究进展[J]. 环境与健康杂志,2013,28(2):182-185.
[25]Cande C, Cohen I, Daugas E, et al. Apoptosis-inducing factor (AIF): a novel caspase-independent death effector released from mitochondria. Biochimie. 2002;84(2-3): 215-222.
[26]Zou H, Li Y, Liu X, et al. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 1999;274(17): 11549-11556.
[27]Hu Y, Benedict MA, Ding L, et al. Role of cytochrome c and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated caspase-9 activation and apoptosis. EMBO J. 1999;18(13):3586-3595.
[28]Saleh A, Srinivasula SM, Acharya S, et al. Cytochrome c and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation. J Biol Chem. 1999;274(25):17941-17945.
[29]Brentnall M, Rodriguez-Menocal L, De Guevara RL, et al. Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis. BMC Cell Biol. 2013;14:32.
[30]Hirota M, Ito T, Okudela K, et al. Cell proliferation activity and the expression of cell cycle regulatory proteins in oral lichen planus. J Oral Pathol Med. 2002;31(4):204-212.
[31]Sutton VR, Davis JE, Cancilla M, et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 2000; 192(10):1403-1414.
[32]Sitailo LA, Tibudan SS, Denning MF. Activation of caspase-9 is required for UV-induced apoptosis of human keratinocytes. J Biol Chem. 2002;277(22):19346-19352.
[33]Wurstle ML, Laussmann MA, Rehm M. The central role of initiator caspase-9 in apoptosis signal transduction and the regulation of its activation and activity on the apoptosome. Exp Cell Res. 2012;318(11):1213-1220.
[34]李志恒. 大鼠颅脑损伤后Caspase-9、MMP-3和NGB表达变化的研究[D]. 乌鲁木齐:新疆医科大学,2012.
[35]Guerrero AD, Schmitz I, Chen M, et al. Promotion of Caspase Activation by Caspase-9-mediated Feedback Amplification of Mitochondrial Damage. J Clin Cell Immunol. 2012;3(3). pii: 1000126.
[36]Chavez-Galan L, Sada-Ovalle I, Baez-Saldana R, et al. Monocytes from tuberculosis patients that exhibit cleaved caspase 9 and denaturalized cytochrome c are more susceptible to death mediated by Toll-like receptor 2. Immunology. 2012;135(4):299-311.
[37]Wang YJ, Niu XP, Yang L, et al. Effects of celecoxib on cycle kinetics of gastric cancer cells and protein expression of cytochrome C and caspase-9. Asian Pac J Cancer Prev. 2013; 14(4):2343-2347.
[38]Fang F, Gong PS, Zhao HG, et al. Mitochondrial Modulation of Apoptosis Induced by Low-dose Radiation in Mouse Testicular Cells. Biomed Environ Sci. 2013;26(10):820-830.
[39]刘江涛,郭雄,吴翠艳,等. 线粒体细胞色素c介导的caspase-9激活通路参与大骨节病关节软骨细胞凋亡的发生机制[J]. 西安交通大学学报:医学版,2011,32(5):580-584.
[40]曹军军,杨茂伟,郭宝磊,等. 高糖通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2012,28(12): 1109-1114.

引言

错颌畸形严重影响患者颜面美观及口腔功能。功能矫形通过功能矫治器施加生物力作用于面颌部肌肉，使之形态和功能发生适应性改建，以纠正错颌畸形。矫正过程中成肌细胞是适应性改建的主要体现者，但其具体机制尚不明确。已有学者在宏观层次上证实了在力学信号作用下面颌部肌肉可以发生适应性改建^[1-2] 。在微观层次上亦有研究证实周期性牵张应力导致成肌细胞凋亡^[3] 。
细胞凋亡主要通过两条途径^[4] ，即Fas/FasL途径和线粒体途径。有研究表明，应力介导的成肌细胞凋亡并不依赖Fas/FasL这一外源性信号通路^[5] ，而线粒体途径是凋亡的主要途径，也是近年来的研究热点。线粒体凋亡通路，即细胞损伤后线粒体功能障碍，膜通透性改变^[6] ，凋亡蛋白包括细胞色素C^[7-8] 、凋亡蛋白酶活化因子1及第2个线粒体衍生的半胱天冬氨酸蛋白酶激活剂等从线粒体释放到胞浆^[9-11] ，半胱天冬氨酸蛋白酶9与之形成凋亡体 (apoposome)并被激活，随之引起半胱天冬酶家族的瀑布式活化和细胞凋亡^[12] 。
半胱天冬氨酸蛋白酶9是半胱天冬氨酸蛋白酶家族中的重要一员，是线粒体凋亡信号通路终端效应酶半胱天冬氨酸蛋白酶3的上游关键酶^[13-14] ，其激活主要有两条途径：一是从线粒体释放出来的细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子1结合，形成的复合物激活半胱天冬氨酸蛋白酶9前体，活化的半胱天冬氨酸蛋白酶9激活半胱天冬氨酸蛋白酶的下游级联如半胱天冬氨酸蛋白酶3。另一条途径是当膜电位(ΔΨm)下降时，从线粒体外室释放的凋亡诱导因子激活半胱天冬氨酸蛋白酶3。而半胱天冬氨酸蛋白酶9的活化被认为是细胞凋亡机制中的重要环节^[15-16] 。目前研究半胱天冬氨酸蛋白酶9在应力介导成肌细胞凋亡中的作用少见文献报道。
因此，课题以大鼠L6成肌细胞为实验对象，构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型，通过多通道细胞牵张应力加载系统，分别对待测细胞持续施加不同时间的周期性张应力，探讨半胱天冬氨酸蛋白酶9在不同时间周期性张应力作用下的表达变化，为阐明应力诱导成肌细胞凋亡的力学信号转导机制提供实验室基础。

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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2013年3至12月在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。

材料：

实验方法：

细胞培养：将大鼠 L6 成肌细胞株培养于含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，于37 ℃，体积分数5%CO₂的恒温培养箱内培养。一两天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状态。待细胞长满瓶底80%以上时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化、传代。细胞生长状态良好时调整细胞接种浓度为3×10⁸L^-1后接种于5个6孔Bioflex柔性细胞培养板中，加入2 mL含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM，24 h后换液，待细胞生长达80%时，更换无血清的高糖DMEM，继续培养24 h，达到细胞同步化的目的^[17-18]。

实验分组：将培养皿与多通道细胞牵张应力加载系统连接，将6个培养板随机分为5组，分别为不加力组，加力1 h组、加力6 h组、加力12 h组、加力24 h组。以不加力组为对照组，加力的幅度为15%细胞形变率，频率为10循环/min，每循环包括3 s拉伸/3 s松弛。倒置相差显微镜下对成肌细胞的形态学改变和生长状况进行观察。

RT-PCR检测半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA表达：加力结束后，收集各组成肌细胞，按RNA提取说明书提取各组细胞的总RNA，分光光度计检测RNA的质量浓度和纯度。定量反转录成cDNA，采用上海生工生物技术有限公司合成的引物进行扩增。

PCR扩增条件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、50 s，72 ℃、10 min，重复35个循环。扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下拍照。计算机凝胶成像系统观察半胱天冬氨酸蛋白酶9mRNA表达，拍照。Quantity One软件进行图像分析，计算灰度值后，进行统计学分析。

Western-Blot检测半胱天冬氨酸蛋白酶9蛋白质表达：收集各组成肌细胞，提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，加入半胱天冬氨酸蛋白酶9及内参单克隆抗体后4 ℃过夜，加相应的辣根过氧化酶标记的二抗再室温摇床孵育1 h，加显影液后放入计算机显影系统内，对半胱天冬氨酸蛋白酶9及内参蛋白的表达量进行观察、拍照，并保存记录；Quantity One软件进行图像分析，计算灰度值后，进行统计学分析。

主要观察指标：成肌细胞形态和生长状态，半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA及蛋白质表达。

统计学分析：第一作者采用SPSS 17.0软件完成结果统计，数据以x(_)±s表示。组内数据比较采用方差分析，组间数据比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

功能矫形是众多正畸医生用来矫治错颌畸形的重要手段之一。临床上，口腔正畸医生通过功能矫治器施加生物力作用于面颌部肌肉，使之形态和功能发生适应性改建，以纠正错颌畸形。矫正过程中成肌细胞是适应性改建的主要体现者，有研究证实周期性牵张应力导致成肌细胞凋亡，而且随着加力时间的延长，成肌细胞凋亡率逐渐增加^[3] ，但其具体机制尚不明确。
细胞凋亡主要通过两条途径^[4] ：一条是死亡受体凋亡途径，即死亡受体如Fas、肿瘤坏死因子а等与相应的死亡配体FasL、肿瘤坏死因子受体Ⅰ结合，激活细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶8，再激活半胱天冬氨酸蛋白酶3，6，7导致细胞凋亡的发生^[19] ；另一条为线粒体途径^[20] 。有研究表明，应力介导的成肌细胞凋亡并不依赖Fas/FasL这一外源性信号通路^[5] ，而线粒体途径是凋亡的主要途径，也是近年来的研究热点。有研究表明，细胞应激反应或凋亡刺激信号可以导致线粒体通透性转换孔不可逆的过度开放，造成线粒体膜电位去极化、线粒体肿胀、线粒体内膜断裂，位于线粒体膜间隙的细胞色素C和凋亡诱导因子释放入胞浆，胞内Ca ²⁺浓度升高，pH值下降^[6,21-25] 。细胞色素C在dATP/ATP的帮助下与凋亡激活蛋白酶1以及半胱天冬氨酸蛋白酶9前体结合成凋亡体(apoposome)^[26-28] ，并充分聚集，启动半胱天冬氨酸蛋白酶9形成全酶，导致半胱天冬氨酸蛋白酶9前体自动活化，活化的半胱天冬氨酸蛋白酶9可以继续活化下游的半胱天冬酶家族，比如在细胞凋亡中起主要作用的半胱天冬氨酸蛋白酶3和半胱天冬氨酸蛋白酶7^[29] ，引起半胱天冬酶级联反应，诱发凋亡^[28] 。而且研究表明半胱天冬氨酸蛋白酶3又可以反过来促进半胱天冬氨酸蛋白酶9的激活，形成正反馈^[30] 。可见，半胱天冬氨酸蛋白酶9作为凋亡启动因子^[31] ，处在半胱天冬氨酸蛋白酶瀑布式活化的顶端，是线粒体途径中的关键蛋白酶^[32] ，可以导致细胞不可逆性死亡^[19] ，对于整个线粒体凋亡途径的激活尤为重要。
半胱天冬氨酸蛋白酶9是半胱天冬氨酸蛋白酶家族中的重要一员，是线粒体凋亡信号通路终端效应酶-半胱天冬氨酸蛋白酶3的上游关键酶^{[23, 33-34]} 。与半胱天冬酶家族其他成员一样，半胱天冬氨酸蛋白酶9前体以无活性酶原形式存在。半胱天冬氨酸蛋白酶9前体与凋亡蛋白酶活化因子1皆存在一个由6个α螺旋组成的特殊结构域，称为CARD(for caspase recruitment domain)，当线粒体受损伤时释放出的凋亡蛋白酶活化因子1与细胞色素C结合形成复合物，并通过CARD结构域的疏水作用和静电作用与半胱天冬氨酸蛋白酶9前体结合，从而激活半胱天冬氨酸蛋白酶9前体，半胱天冬氨酸蛋白酶9前体自发裂解为 Mr 35 000的活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9与一个Mr 10 000的小亚基，活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9将进一步激活半胱天冬酶家族的下游级联如半胱天冬氨酸蛋白酶3。半胱天冬氨酸蛋白酶3可通过正反馈调节半胱天冬氨酸蛋白酶9的激活^[35] 。
文章通过对各加力组成肌细胞施加不同时间相同力值的周期性张应力后，运用RT-PCR技术检测周期性张应力作用下各组成肌细胞半胱天冬氨酸蛋白酶9的mRNA的变化，发现半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA含量逐渐增加，且24 h达到峰值，表明随着加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9的基因表达量逐渐增加；采用Western Blot技术检测周期性张应力作用下各组成肌细胞半胱天冬氨酸蛋白酶9蛋白含量的表达变化，发现随着加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9前体的蛋白表达量逐渐降低，24 h时最低，而活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9的蛋白含量逐渐增加，且24 h达到峰值。由此可见，以无活性酶原形式存在的半胱天冬氨酸蛋白酶9前体随着加力时间的延长逐渐减少，活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9逐渐增加，即随加力时间的延长，半胱天冬氨酸蛋白酶9活性逐渐增强，可见半胱天冬氨酸蛋白酶9参与了周期性张应力作用下的力学信号传导。
前人研究表明，周期性张应力可诱导成肌细胞发生凋亡^[17-18] ，而且随加力时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加，这与半胱天冬氨酸蛋白酶9的基因表达量及活性随加力时间的延长而不断增多及增强的趋势存在一致性，由此可推断半胱天冬氨酸蛋白酶9可能参与了应力介导的成肌细胞凋亡；亦有研究表明，活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9在正常细胞中一般不表达^[36] ，当细胞发生凋亡时其表达量增加^[37-40] ，而实验结果表明活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9表达量随加力时间的延长而不断增加，此结果亦证实了半胱天冬氨酸蛋白酶9在应力介导的成肌细胞凋亡中发挥了一定的作用。
因此可以得出结论，半胱天冬氨酸蛋白酶9参与了周期性张应力作用下的力学信号传导，且在应力介导的成肌细胞凋亡中发挥了一定的作用；线粒体途径可能参与了应力介导的成肌细胞的凋亡过程，其具体机制尚待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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细胞凋亡主要通过两条途径：一条是死亡受体凋亡途径，即死亡受体如Fas、肿瘤坏死因子а等与相应的死亡配体FasL、肿瘤坏死因子受体Ⅰ结合，激活细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶8，再激活半胱天冬氨酸蛋白酶3，6，7导致细胞凋亡的发生；另一条为线粒体途径。有研究表明，应力介导的成肌细胞凋亡并不依赖Fas/FasL这一外源性信号通路，而线粒体途径是凋亡的主要途径，也是近年来的研究热点。有研究表明，细胞应激反应或凋亡刺激信号可以导致线粒体通透性转换孔不可逆的过度开放，造成线粒体膜电位去极化、线粒体肿胀、线粒体内膜断裂，位于线粒体膜间隙的细胞色素C和凋亡诱导因子释放入胞浆，胞内Ca2+浓度升高，pH值下降。细胞色素C在dATP/ATP的帮助下与凋亡激活蛋白酶1以及半胱天冬氨酸蛋白酶9前体结合成凋亡体(apoposome)，并充分聚集，启动半胱天冬氨酸蛋白酶9形成全酶，导致半胱天冬氨酸蛋白酶9前体自动活化，活化的半胱天冬氨酸蛋白酶9可以继续活化下游的半胱天冬酶家族，比如在细胞凋亡中起主要作用的半胱天冬氨酸蛋白酶3和半胱天冬氨酸蛋白酶7，引起半胱天冬酶级联反应，诱发凋亡。而且研究表明半胱天冬氨酸蛋白酶3又可以反过来促进半胱天冬氨酸蛋白酶9的激活，形成正反馈。可见，半胱天冬氨酸蛋白酶9作为凋亡启动因子，处在半胱天冬氨酸蛋白酶瀑布式活化的顶端，是线粒体途径中的关键蛋白酶，可以导致细胞不可逆性死亡，对于整个线粒体凋亡途径的激活尤为重要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导

Caspase-9 in myoblasts is involved in mechanical signal transdunction under cyclic stretch

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[3]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[4]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[5]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[6]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[7]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[8]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[9]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[10]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[11]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[12]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[13]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[14]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[15]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.